鸿畅化工浅谈聚丙烯酰胺凝胶配制制备过程:
1、 按要求装配好垂直电泳板,两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂糖封边,防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出。
2、 将装好的玻璃电泳板倾斜成45~60℃角。
3、 按表3配制所需%浓度凝胶的毫升数。
4、 加入TEMED后,立即混匀,缓缓倒入两玻璃板间的胶床中,直到液体接近溢出时为止。
5、 立即插入适当的梳子,密切注意防止梳齿下产生气泡,用一有力的夹将梳子夹在一边的玻璃板上,然后将玻璃板斜靠在物体上,使成10°角,可减少液体泄漏的机会。
6、 室温聚合一小时后,将玻璃板插入电泳槽中,上紧,倒入*缓冲液。
7、 小心取出梳子,加样。
原理:在SSCP测定中,双链DNA(dsDNA)被变性成为单链DNA(ssDNA),每一条单链DNA都基于它们的内部序列而呈现出一种独有的折叠构象,即使同样长度的DNA单链因其碱基顺序不同、甚至单个碱基的不同会形成不同的构象。这些单链DNA在非变性条件下,用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,单链DNA的迁移率和带型,都取决于其折叠构象和电泳时的温度。
SSCP与变性凝胶电泳基本一致,不同之处有以下几点:
a. SSCP使用非变性凝胶进行电泳,即在凝胶配制中不加入变性剂。我室常用8%非变性胶(丙烯酰胺 80g,N- N,-亚甲双丙烯酰胺 * g,10×TBE 50ml,加水定容到1L)
b. 工作环境,由于SSCP受温度影响,所以在电泳过程中应防止温度的升高,所以电泳环境为电压400V,电流50mA,单板电泳功率为9W,不用预热。缓冲液最好用新配制的。
c. 由于电泳功率较低,所以电泳时间较长,通常需要10小时以上,因此一般电泳需要过夜。室温在25。C以下。
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